به مرکز تحقیقات ژنتیک خوش آمدید
 
قالب وبلاگ

دو روش از انتقال ژن به گیاهان

1. بمباران ژنی

   کارایی این روش در انتقال ژن برای اولین بار با بیان موقتی ژن در اپیدرم پیاز توسط کلین و همکاران (1987) و بعداً با بیان موقت ژن های gus و cat در ذرت و برنج ، سویا و گندم گزارش گردید . این روش امروزه برای ترا ریزش اکثر گونه های گیاهی و برخی حیوانات و قارچها و باکتری ها مورد استفاده قرار می گیرد. اساس این روش بر این استوار است که DNA مورد نظر که بر روی ذرات ریز طلا و یا تنگستن رسوب داده شده، با فشار بالای هوای فشرده و یا با استفاده از یک تفنگ ژنی بیولیستیک به طرف بافت هدف پرتاب می گردند .این روش علاوه بر این که برای تراریزش اکثر گونه های گیاهی مورد استفاده قرار می گیرد ، برای مطالعات پایه ای تراریزش ، تغییرات بیان ژن ها ، در مطالعات مربوط به درک نقش اجزای ضروری ژنها ، آنالیز سریع نواحی پیش بر از لحاظ اجزای افزاینده و خاموش کننده نسخه برداری ، اثرات اینترون و نقش نواحی خاتمه دهنده در بیان ژنها پایداری mrna و در مطالعات مربوط به بیان اختصاصی ژنها در بافتها کاربرد دارد.

برای مشاهده کامل مقاله بر روی ادامه مطلب کلیک کنید. 


2. انتقال ژن با وساطت اگروباکتروم

   باکتری های جنس اگروباکتریوم زندگی آزادی دارند ولی باکتریهای خاکی فرصت طلبی وجود دارند که ظرفیت زیادی برای بر همکنش ژنتیکی با گیاهان حساس پیدا کرده اند این بر همکنش به قرار گرفتن پایدار بخشی باکتری درون ژنوم گیاه منتج می شود.این توانایی طبیعی باکتری برای تغییرهای ژنتیکی بافت گیاه است که اساس کلی تکنولوژی انتقال ژن را تشکیل می دهد. تمام گونه های جداسازی شده اگروباکتریوم ، بر اساس علایمی که روی گیاهان ایجاد می کنند شناخته می شوند . بنابراین اگروباکتریوم تومه فاسینس ، غده واگروباکتریوم ریزوژنز در محل آلودگی روی گیاهان حساس ، ریشه به وجود می آورد . این علایم بازگو کننده ،اختلافات اساسی د رفرایند انتقال ژن نیست ولی د ربردارنده قطعه DNA حاوی اطلاعات ژنتیکی است این قطعه T-DNA,DNA یا DNA انتقال دهنده نامیده می شود. اگروباکتریوم حاوی یک پلاسمید است که T.DNA قسمتی از آن می باشد به پلاسمید اگروباکتریوم Ti پلاسمید می گویند که القاء کننده غده می باشد بنابراین تبدیل درونی یک گونه اگروباکتریوم به گونه دیگر به سادگی با جایگزینی Ti پلاسمید امکانپذیر است. آلودگی گیاه به اگروباکتریوم با جراحت اتفاقی بافت گیاهی آغاز می شود .محل زخم مخلوطی از چندین ترکیب را آزاد می کند که ماهیت آن در بین گیاهان متفاوت است و اغلب ماهیتی فنلی دارند این ترکیبات از زخم انتشار می یابند و در غلظتهای کمتر ، برخی از آن ها شیمیو تاکسی مثبتی روی باکتری اعمال می کنند شیمیوتاکسی احتمالاً یکی از عوامل سهیم در کلون سازی محل زخم است چندین عامل دیگر نیز وجود دارند که ممکن است در این کلون سازی سهیم باشند .این عوامل 1ـ تشکیل برون سلولی میکروفیبریلهای سلولزی توسط باکتریها روی سطح تماسی یا مجاورتی سلول های گیاهی 2ـ سنتز و آزاد سازی دسته ای از متابولیت های مشتق شده از اسیدهای آمینه توسط بافت گیاهی تغییر شکل یافته که اوپین ها (opines) خوانده می شوند، را در بر می گیرند. یک نقش ترکیبات مترشحه از زخم ، القای برخی ژنهای باکتریایی است که بروز آن ها برای انتقال T.DNA الزامی است.

 تنها دو منطقه روی Ti پلاسمید وجود دارند که برای این انتقال ضروری هستند . منطقه T.DNA و دیگری منطقه ای که Vir ( شدت بیماری زایی ) خوانده می شود .اگر چه این دو منطقه به تمام پلاسمیدهای رسمی اتصال دارند لیکن آنها نیز موقعی انجام وظیفه خواهند کرد که جدا شده باشند . اکثر منطقه T.DNA می تواند حذف یا غیر فعال شود بدون آنکه در انتقالش تاثیر گذارد ؛ تنها بخشهای T.DNA که برای انجام این عمل ضروری هستند ، 25 جفت بازی هستند که مستقیماً مجاور منطقه T.DNA زنجیرهای تکرار شده قرار دارند. منطقه Vir در سلولهای گیاهی تغییر شکل یافته (transformed) یافت نشده است. در باکتری این منطقه موقعی می تواند عمل کند که در مناطق حواشی ‍T.DNA قرار گیرد. این امر بیان کننده آن است که ژنهای Vir ، محصولات آنها ابتدائاً یا منحصراً در باکتری عمل می کنند.ژنهای منطقه Vir بایستی نقش عمده ای در انتقال T.DNA بازی کنند. تجزیه و تحلیل های اخیر از ساختار و تنظیم آنها دیدگاههای ارزشمندی را فراهم نموده است .  رونویسی از بخش اعظم جایگاههای ژنی شناخته شده منطقه Vir به طور همتراز و مثبتی توسط محصولات خود تنظیم شده ژنهای VirA ، VirG  و ترکیبات فنلی موجود در ترشحات جراحتی گیاه تنظیم می شود . احتمال دارد VirA ، VirG با هم یک واحد تنظیمی را تشکیل می دهد که Vir A به ترکیبات مترشحه زخم در غلظتهای بیشتر از آنچه که مورد نیاز شیمیوتاکسی است ، حساس می شوند و به نوبه خود با محصول VirG برای فعال کردن رونویسی جایگاههای ژنی VirD,Vir بر همکنش می دهند.

    چنانکه عنوان شد، T-DNA  منطقه ای از Ti پلاسمید است که به صورت داخل شده در ژنوم هسته ای سلولهای گیاهی حساس دیده می شود .در تمام Ti پلاسمیدها که به طور طبیعی یافت می شوند، ژنهای موجود در DNA – T شان برای عمل در گیاهان تکامل یافته نه در باکتری . بارزترین این اعمال ، آنهایی هستند که به تولید اکسین ها سیتوکینین ها یا هر دو منتج می شود. این به ظهور علایم بیماری غده زایی واستقلال فیتوهورمونی رشد سلول تغییر شکل یافته در محیط کشت منتهی می گردد . این تغییر فنوتیپ به از دست دادن توانایی باززایی در بافت تغییر شکل یافته می انجامد . Ti پلاسمید ناقلی طبیعی برای انجام عمل مهندسی ژنتیک گیاهان دولپه است، لیکن دو مشکل بسیار مشهود برای استفاده از آن وجود دارد. اولین مشکل این است که اندازه پلاسمید (200 کیلو جفت باز) دستکاری آن را مشکل می سازد و عمده ترین دلیل آن تعداد زیاد جایگاههای آنزیمی محدود الاثر (enzmerestriction)موجود در یک چنین پلاسمید بزرگی است .دوم اینکه فنو تیپ تغییر یافته غده ای مهاجم است و لذا تحت نفوذ در آوردن شرایط رشد جهت باززایی گیاهان کامل از سلولهای تغییر ژنوم یافته بسیار دشوار است. در همین راستا و برای غلبه بر این مشکلات چندین استراتژی شکل گرفته است. اولین و عمومی ترین استراتژی ، برداشتن منطقه T-DNA  و وارد کردن آن درون یک پلاسمید آزمایشگاهی معمولی همچون PBR322  است. به این صورت T-DNA می تواند در اشریشیاکلی کلون شود . این امر T-DNA کافی برای تحقیق فراهم خواهد کرد. بعد از آن معمولاً قطع ژنهای Onc صورت می پذیرد . انجام این عمل ، این اطمینان را می دهد که اگر سلولهای گیاه میزبان با T-DNA نو ترکیب تغییر شکل یابند، تولید گیاه کامل از سلولهای تغییر شکل یافته ساده تر خواهد بود. سوم این که T-DNA باقی مانده مستلزم آن است که برای دریافت ژنهای خارجی متناسب شود . در اینجا باید متذکر شد که اگر چه ژن نوپالین سنتاز (nos) یک پلاسمید باکتریایی است ، لیکن دارای علایم پروموتور و پایانی است که به وسیله گیاه میزبان تشخیص داده می شود. بنابراین ژن نوپالین سنتاز می تواند به عنوان یک ژن علامت گذار (marker) یا گزارشگر (reporter) برای تغییر شکل مورد استفاده قرار گیرد. در صورتی که یک علامت گذار انتخابی مورد نیاز باشد، ژن باکتریایی به رمز درآورنده نئومایسین فسفوترانسفراز از(NTP ، که مقاومت به کانامایسین را ایجاد می کند) اغلب بین علایم پروموتور و پایانی و پس از قطع منطقه به رمز در آورنده نوپالین سنتاز قرار داده می شود. بنابراین ژن باکتریایی را تحت کنترل توالی های تنظیمی نوع شاخصی از گیاه در می آورد. در واقع هر ژنی در این مکان وصل شود ولی برای بسیاری از مقاصد ، تحت کنترل درآوردن توالی های تنظیمی خود آن ژن جایگزین شده ضروری است.

   بایستی تاکید کرد که پلاسمیدی چون PBR322 که حامل یک منطقه T-DNA  دوخته شده (tailored) است، ژنهای Vir را که برای انتقال موفق T-DAN به درون ژنوم میزبان ضروری می باشند ، شامل نمی شود . این مشکل با تجهیز کردن ناقل مناسب شده درون اگروباکتریوم که Ti پلاسمید را حمل می کند ، حل می شود. در صورتی که Ti پلاسمید کامل باشد ، توالی مشتق شده از T-DAN در PBR322 شانس زیادی برای وارد شدن مجدد به درون Ti پلاسمید از طریق نو ترکیبی مشابه در توالی های کناری تکرار شده ، دارد . این سیستم به سیستم ادغام مشترک (Co-integrative system) معروف است. راه دیگر اینکه پلاسمید PBR322-T-DNA دوخته شده ممکن است درون سلول اگروباکترویومی که حامل Ti پلاسمید است و T-DNA از آن حذف گردیده ، وارد شده است. منطقه Vir روی این پلاسمید نیز در ارتقاء انتقال T-DNA به ژنوم میزبان موثر است حتی اگر چه DNA-T اکنون در مولکول دیگری قرار گرفته باشد . سیستمهایی از این قبیل به سیستمهای ناقل دوگانه (binary Vector sys) معروفند . این دو سیستم با موفقیت برای انتقال ژنهای خارجی به سلولهای گیاهی مورد استفاده قرار گرفته اند .

  مهندسی ژنتیک گیاهان با T-DNA نو ترکیب معمولاً از طریق شناورسازی قطعات برگی روی سوسپانسیونی از اگروباکتریوم واجد پلاسمید مناسب حاصل می شود. اگروباکتریوم به لبه های مجروح قطعات برگی هجوم می برد و پس از میزان محدودی تقسیم سلولی ، در حاشیه قطعات برگی ، تشکیل نوساقه از سلولهای تغییر شکل یافته القا می شود. سپس نوساقه ها با قرار گرفتن در یک محیط کشت مناسب ، ریشه می دهند . گیاهانی که بدین طریق مهندسی شده اند، با ژنهای قرار گرفته تحت کنترل پروموتور nos ، یا از سایر پروموتورهای طبیعی گیاه، حالت کلی تری از بروز ژنها را در سراسر گیاه نشان می دهند . ژنهای انتقال یافته با DNA هسته ای میزبان ادغام می شود و مطابق ژنتیک عادی مندلی توارثی می شوند. سیستم تجربی مفید دیگر ، از یک سری آزمایشات بسیار جدیدی که توسط گروه روبرتا اسمیت (Roberta smith,s group) در دانشگاه A&M تکزاس انجام شده ، شکل گرفته است. در این آزمایشات رئوس ساقه ای جدا شده از دانه رستهای اطلسی به وسیله آلودگی با اگروباکتریوم که پرونده یک Ti پلاسمید حامل ژنهایی برای مقاومت کانامایسین و بتاگالاکتورونیداز بودند، تغییر شکل یافتند.

       استفاده از اگروباکتریوم حامل پلاسمیدهای نو ترکیب با T-DNA مهندسی شده هم اکنون یکی از نوید بخش ترین روشهای کاربردی تجاری مهندسی ژنتیک گیاه است. طیف وسیع میزبانهای اگروباکتریوم ، آن را سیستم مناسبی برای به کارگیری در بسیاری از گیاهان دولپه ای مناسب می سازد. تا این تاریخ اکثر آزمایشات روی گیاهانی صورت گرفته است که باززایی آنها بسیار ساده بوده ، بویژه اعضای خانواده های سیب زمینی همچون سیب زمینی ، گوجه فرنگی ، توتون و اطلسی ، باضافه چندین گونه دیگر از جمله آفتابگردان ، ولی به روشنی نیروی بالقوه ای برای کاربرد این تکنیک ها برای شمار زیادی از محصولات زراعی پهن برگ همچون لوبیای روغنی ، شلغم روغنی و حتی گونه های درختی وجود دارد. به نظر می رسد در شرایط طبیعی ، اگروباکتریوم گیاهان تک لپه ای را آلوده نمی کند. بنابراین دستکاری ژنتیکی غلات با استفاده از یک Ti پلاسمید انتقال یافته به وسیله اگروباکتریوم ، غیر عملی به نظر می رسد . هر چند داده هایی وجود دارند که بیان می کنند اگروباکتریوم می تواند در برخی شرایط ، تک لپه ایها را آلوده کند، لیکن تشکیل Crown-gll را باعث نمی شود

برگرفته از پایان نامه کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی دانشگاه فردوسی مشهد دکتر دورانی

[ ۱۳۸۸/۱٠/٧ ] [ ۱٢:۱٧ ‎ق.ظ ] [ امیر سالار سید رزاقی ] [ نظرات () ]
.: Weblog Themes By WeblogSkin :.
درباره وبلاگ

دانشجوی مهندسی ژنتیک (گیاهی)
لینک دوستان
امکانات وب