به مرکز تحقیقات ژنتیک خوش آمدید
 
قالب وبلاگ

در اواخر دهه 1930، لینوس پائولینگ و رابرت کوری با استفاده از روش کریستالوگرافی اشعه X ، ساختار دقیق آمینواسیدها و پپتیدها را مورد بررسی قرار دادند. هدف آنها از این مطالعات، تعیین فاصله پیوند بین اتمها و زوایای پیوند بود تا با استفاده از این اطلاعات بتوانند کونفورماسیون ( آرایش فضایی گروههای متصل به یک اتم  می توانند حول یک پیوند بچرخند) پروتئین ها را پیشگویی کنند.

برای مشاهده ادامه متن بر روی ادامه مطلب کلیک کنید. 

 


یکی از یافته های ارزشمند این دو محقق آن بود که واحد پپتیدی محکم و مسطح است. هیدروژن گروه آمینی در این پیوند همیشه در موقعیت Trans نسبت به اکسیژن گروه کربونیل قرار می گیرد. پیوند میان اتم کربن گروه کربونیل و اتم نیتروژن دارای آزادی چرخش نیست و تقریباً مانند یک پیوند دوگانه عمل می کند. طول این پیوند، کوتاه و در حدود 32/1 آنگستروم بوده و میانگین طول پیوند ساده C-N ( 49/1 آنگستروم) و پیوند دوگانه C=N ( 27/1 آنگستروم) است و به همین دلیل، خصوصیات یک پیوند دوگانه نسبی را نشان می دهد. پیوند میان کربن α و کربن گروه کربونیل از نوع پیوند ساده بوده و طول آن 51/1 آنگستروم است. همچنین پیوند بین کربن α در اسید آمینه دوم و نیتروژن نیز از نوع پیوند ساده ( 46/1 آنگستروم) است. بنابراین درجه آزادی چرخش حول این پیوندها زیاد بوده و اتمهایی که در پیوند پپتیدی درگیر شده اند، روی یک خط قرار نمی گیرند ولی در یک صفحه هستند.

توالی اسیدهای آمینه ساختمان اولیه پپتیدها را مشخص می کند :

برای تعیین ساختمان اولیه یک پلی پپتید باید تعداد، ساختمان و ترتیب همه ریشه های اسیدهای آمینه را مشخص کرد.

جایگزینی تنها یک اسید آمینه بجای اسید آمینه دیگر در توالی خطی بیش از 100 اسید آمینه می تواند منجر به کاهش یا از بین رفتن فعالیت بیولوژیک شده، عواقب بالقوه و وخیمی به جای گذارد، مانند بیماری کم خونی سلول داسی شکل.

برای نامیدن اسیدهای آمینه موجود در پپتیدها از علائم اختصاری استفاده می شود :

برای نمایش ساختمان اولیه پپتیدها می توان از دو نوع علامت اختصاری سه حرفی و یک حرفی اسیدهای آمینه استفاده کرد. استفاده از حرفی که با خطوط مستقیم بهم وصل شده اند، روش شناخته شده و صریح برای نمایش ساختمان اولیه پپتیدها است. در صورت استفاده از علایم اختصاری یک حرفی این خطها حذف می شوند. در صورتی که ترتیب دقیق بخشی از ساختمان پلی پپتید مشخص نباشد، ریشه های مشکوک و مورد نظر درون کروشه قرار گرفته و با علامت کاما از هم جدا می شوند.              

پپتیدهای موجود در سیستم های بیولوژیک، از نظر اندازه متفاوتند و ممکن است بصورت انواع کوچک با دو یا سه اسید آمینه تا انواع بسیار بزرگ متشکل از هزاران اسید آمینه دیده شوند.

دو مولکول اسید آمینه می توانند بطور کووالان از طریق یک پیوند آمیدی یا پیوند پپتیدی به یکدیگر متصل شده و ایجاد یک دی پپتید کنند. این پیوند با برداشت عناصر یک مولکول آب ( دهیدراتاسیون ) از گروه α-کربوکسیل یک اسید آمینه و α-آمینوی اسید آمینه دیگر ایجاد می گردد.

گروه α-آمینوی یک اسید آمینه به عنوان یک نوکلئوفیل عمل نموده تا جایگزین گروه هیدروکسیل اسید آمینه دیگر شده و ایجاد یک پیوند پپتیدی ( تیره ) کند.   

تشکیل پیوند پپتیدی مثالی از یک واکنش کندانساسیون است که یکی از کلاس های معمول واکنش ها در سلولهای زنده می باشد. تحت شرایط بیوشیمیایی استاندارد، تعادل واکنش بالا بیشتر به سمت مواد شرکت کننده در واکنش است تا محصول دی پپتیدی. برای اینکه این واکنش از نظر ترمودینامیکی قابل انجام باشد، لازم است گروه کربوکسیل دچار تعییر شیمیایی شده و یا به طریقی فعال گردد که گروه هیدروکسیل آن راحت تر برداشت شود.

سه اسید آمینه می توانند توسط دو پیوند پپتیدی به یکدیگر متصل شده و ایجاد یک تری پپتیدکنند؛ بطور مشابه اسیدهای آمینه با اتصال به یکدیگر تولید تترا پپتید، پنتاپپتید و غیره می کنند. وقتی تعداد کمی از اسیدهای آمینه به این طریق به یکدیگر اتصال می یابند، ساختمان حاصل را اولیگوپپتید گویند. وقتی تعداد این اسیدهای آمینه زیاد باشد، محصول را پلی پپتید می نامند. در ساختمان پروتئین ها ممکن است هزاران اسید آمینه وجود داشته باشد. هر چند گاهی اصطلاحات پروتئین و پلی پپتید بجای یکدیگر بکار می روند، مولکولهایی که به آنها پلی پپتید اطلاق می گردد، عموماً دارای وزن مولکولی کمتر از 10000 هستند.

شکل صفحه بعد ساختمان یک پنتاپپتید را نشان می دهد. اسید آمینه موجود در یک پپتید را اغلب یک ریشه ( قسمت باقیمانده بعد از جدا شدن یک اتم هیدروژن از گروه آمینو و یک عامل هیدروکسیل از گروه کربوکسیل آن )‌گویند. در یک پپتید، ریشه اسید آمینه موجود در انتهای دارای گروه α-آمینو آزاد را ریشه انتهای آمینو ( یا انتهای N ) و ریشه موجود در انتهای دیگر دارای یک گروه کربوکسیل آزاد را ریشه انتهای کربوکسیل ( یا انتهای C ) گویند.                    

هرچند هیدرولیز یک پیوند پپتیدی یک واکنش انرژی زا است، بخاطر انرژی فعالسازی بالای آن، به آهستگی صورت می گیرد. لذا پیوندهای پپتیدی موجود در پروتئین کاملاً پایدارند و تحت اکثر شرایط داخل سلول، نیمه عمری حدود 7 سال دارند.

ساختمان اولیه بر فعالیت فیزیولوژیک پپتید تاثیر دارد

جایگزینی تنها یک اسید آمینه بجای اسید آمینه دیگر در توالی خطی بیش از 100 اسید آمینه منجر به کاهش یا از بین رفتن فعالیت بیولوژیک شده، عواقب بالقوه و وخیمی به جای گذارد ( مانند بیماری کمخونی سلول داسی شکل ). در بسیاری از اختلالات متابولیک ارثی تنها یک تغییر منفرد از این نوع وجود دارد.

بسیاری از پپتیدها فعالیت فیزیولوژیک دارند

در سلول های جانوران، گیاهان و باکتری ها پلی پپتیدهای مختلفی با وزن مولکولی پایین وجود دارد ( 3 تا 100 ریشه اسید آمینه ) که فعالیت فیزیولوژیکی بارزی بر عهده دارند.

در مولکلول گلوتاتیون، گلوتامات انتهایی N از طریق یک پیوند غیر آلفا پپتیدی به سیستئین متصل شده است. این مولکول مورد نیاز آنزیم های متفاوتی است. گلوتاتیون و آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز در تشکیل پیوندهای دی سولفیدی صحیح در بسیاری از پروتئین ها و هورمونهای پلی پپتیدی شرکت داشته و در متابولیسم گزنوبیوتیکها ( Xenobiotics ) نقش دارند.                       

آنتی بیوتیکهای پلی پپتیدی که توسط قارچ ها ساخته و آزاد می شوند دارای هر دو نوع اسید آمینه D و L و اسیدهای آمینه ای که در پروتئین ها وجود ندارند می باشد. از جمله این آنتی بیوتیکها می توان به تیروسیدن، گرامیسیدین اشاره کرد. این پلی پپتیدهای حلقوی دارای D فنیل آلانین و اسید آمینه غیر پروتئینی اورنیتین می باشند.

 پپتیدها پلی الکترولیت هستند

در هیچ مقدار pH موجود در شرایط فیزیولوژیک، پیوند پپتیدی ( آمیدی ) باردار نیست. بنابراین تشکیل پپتیدها از اسید آمینه در pH برابر 4/7 با از بین رفتن خالص یک بار الکتریکی مثبت و یک بار منفی به ازای هر پیوند پپتیدی تشکیل شده، همراه می باشد. به علت وجود گروههای دو انتهای C و N و گروههای R اسیدی یا بازی، پپتیدها در pH فیزیولوژیک مولکولهایی دارای بار الکتریکی هستند.

 پیوند پپتیدی بطور نسبی ماهیت پیوند دوگانه را دارد

هر چند برای نوشتن ساختمان پپتیدها اتمهای آلفا- نیتروژن و آلفا-کربوکسیل توسط یک پیوند منفرد به هم متصل می شوند، این پیوند در حقیقت ماهیت یک پیوند دوگانه نسبی یا ناقص را دارد.

 

اتمهای اطراف پیوندی که اتمهای C و N را بهم وصل می کند آزادی چرخش ندارد. در نتیجه هر چهار اتمی که در شکل زیر نشان داده شده در یک صفحه قرار داشته یا Coplanar می باشند. این حالت نیمه سختی اتمها ماهیت زیادی در ساختمانهای دیگر پروتئین در مراتب بالاتر از ساختمان اولیه دارد. بر عکس حالت فوق، اتمهای اطراف بقیه پیوندهای موجود در اسکلت پلی پپتیدی آزادی چرخش فراوانی دارند.

 

ابعاد یک زنجیره پلی پپتیدی کاملاً گسترده شده. چهار اتمی که در نواحی سایه دار مشخص شده اند در یک صفحه قرار داشته و پیوند

پلی پپتیدی را تشکیل می دهند. اتم هایی که در نواحی تیره قرار ندارند عبارتند از: اتم کربن آلفا، اتم هیدروژن آلفا و گروه R آلفای هر

اسید آمینه خاص.

نیروهای غیر کووالان بر شکل پپتیدها تاثیر می گذارند

با اینکه یک پلی پپتید ممکن است آرایش فضایی متفاوتی داشته باشد، در یک محلول اشکال معدودی بصورت غالب وجود دارد. وجود این اشکال خاص نشانه دخالت عواملی مانند موانع فضایی، تداخلات نیروهای کلونی، پیوند هیدروژنی و تداخلات هیدروفوبی می باشد.

 پپتیدها را می توان بر اساس خاصیت یونیزاسیون آنها تشخیص داد

پپتیدها تنها دارای یک گروه α-آمینو آزاد و یک α-کربوکسیل آزاد هستند که هر کدام از آنها در یک انتها قرار دارند. این گروهها همانند حالت موجود در اسیدهای آمینه آزاد، یونیزه هستند ولی بخاطر عدم وجود گروههای با بار مخالف بر روی کربن α، ثابت های یونیزاسیون آنها متفاوت می باشد. گروههای α-آمینو و α-کربوکسیل تمامی اسیدهای آمینه غیر انتهایی در ایجاد پیوندهای کووالان پپتیدی شرکت می کنند؛ لذا یونیزه نیستند و نقشی در رفتار اسید- بازی کلی پپتیدها ندارند. هر چند، گروههای R برخی اسیدهای آمینه موجود در یک پپتید، قابلیت یونیزاسیون را دارد و این گروهها در خصوصیت اسید- بازی کلی مولکول همکاری می کنند. بنابراین، رفتار اسید- بازی یک پپتید را می توان از روی گروههای آزاد α-آمینو و α- کربوکسیل و همچنین ماهیت و تعداد گروههای R قابل یونیزاسیون موجود در آن پیش بینی نمود.

 

همانند اسیدهای آمینه پپتیدها دارای منحنی های مشخص تیتراسیون و یک pH ایزوالکتریک ( pI ) خاص می باشند که در آن pH حرکتی در میدان الکتریکی ندارند. از این ویژگی در برخی از تکنیک ها برای جداسازی پپتیدها و پروتئین ها استفاده می گردد. وقتی یک اسید آمینه در ساختمان یک پپتید قرار می گیرد، مقدار  گروه R قابل یونیزاسیون آن مقداری تغییر می نماید. از دست رفتن بار گروههای α- آمینو و α- کربوکسیل، تعامل با سایر گروههای R پپتیدی و عوامل محیطی دیگر می توانند بر روی   اثر بگذارند.

پپتیدها و پلی پپتیدها دارای فعالیت بیولوژیک، از نظر اندازه بسیار متفاوت هستند

در مورد ارتباط وزن های مولکولی پپتیدها و پروتئین های دارای فعالیت با عملکرد آنها، هیچ قاعده ی کلی وجود ندارد. اندازه پپتیدهای طبیعی ممکن است از دو تا هزاران اسید آمینه متفاوت باشد. حتی کوچکترین پپتیدها نیز اعمال بیولوژیکی مهم را انجام می دهند. دی پپتید L- آسپارتیل- L- فنیل آلانین متیل استر، بعنوان یک شیرین کننده مصنوعی است که بطور تجارتی سنتز شده و بنام آسپارتام یا نوتراسوئیت مشهور می باشد.

 

بسیاری از پپتیدها اثرات خود را در غلظت های بسیار پایین به انجام می رسانند. برای مثال، تعدادی از هورمونهای موجود در مهره داران از جنس پپتیدهای کوچک می باشند. از جمله این هورمون های عبارتند از اکسی توسین ( با 9 ریشه اسید آمینه ) که توسط هیپوفیز خلفی ترشح شده و انقباضات رحمی را تحریک می کند، برادی کینین ( 9 ریشه ای ) که مانع التهاب بافت می گردد و فاکتور آزاد کننده تیروتروپین ( 3 ریشه ای ) که در هیپوتالاموس ساخته شده و رهاسازی هورمونهای دیگری بنام تیروتروپین از غده هیپوفیز قدامی را تحریک می کند. تعدادی از سموم قارچی، نظیر آمانیتین و همچنین بسیاری از آنتی بیوتیکها نیز جزء پپتیدهای کوچک می باشند.

مولکولهای دارای اندازه قدری بزرگتر، شامل الیگوپپتیدها و پلی پپتیدهای کوچکی نظیر هورمون انسولین پانکراس می باشند که از دو زنجیر پلی پپتیدی، یکی با 30 و دیگری با 21 ریشه اسید آمینه، تشکیل شده است. هورمون دیگر پانکراس، یعنی گلوکاگون، 29 ریشه دارد و با فعالیت انسولین مخالفت می کند.

تنوع قابل توجهی در طول زنجیره های پلی پپتیدی موجود در پروتئین ها وجود دارد. سیتوکروم c انسانی از 104 ریشه اسید آمینه تشکیل شده است که در یک زنجیر به یکدیگر متصل هستند. کیموتریپسین گاوی دارای 245 ریشه می باشد. اکثر پلی پپتیدهای موجود در طبیعت، کمتر از 2000 ریشه اسید آمینه دارند.

تعدادی از پروتئین ها از یک زنجیر پلی پپتیدی تشکیل شده اند، ولی بقیه آنها، تحت عنوان پروتئین های چند زیر واحدی، متشکل از دو یا چند پلی پپتید هستند که بطور غیر کووالان به یکدیگر متصل می باشند. زنجیره پلی پپتیدی موجود در یک پروتئین چند زیر واحدی ممکن است یکسان و یا متفاوت باشند. درصورتیکه حداقل دو زنجیر مشابه باشد، پروتئین را اولیگومر گویند و واحدهای مشابه ( متشکل از یک یا چند زنجیر پلی پپتیدی ) را پروتومر می نامند. برای مثال هموگلوبین از چهار زنجیر، شامل دو زنجیر مشابه α و دو زنجیر مشابه β، تشکیل شده است که توسط تعامل های غیر کووالان در کنار یکدیگر قرار دارند.

تعدادی از پروتئین ها دارای دو یا چند زنجیره پلی پپتیدی هستند که توسط پیوندهای کووالان به یکدیگر متصل می باشند. برای مثال، دو زنجیره پلی پپتیدی انسولین توسط پیوندهای دی سولفیدی به یکدیگر متصل هستند.

با تقسم وزن مولکولی بر 110 می توان تعداد حدودی ریشه های اسید آمینه موجود در یک پروتئین ساده فاقد گروه شیمیایی دیگر را محاسبه نمود. هر چند متوسط وزن مولکولی 20 اسید آمینه معمول در حدود 138 می باشد، اسیدهای آمینه کوچکتر در پروتئین ها فراوانتر هستند؛ در صورتیکه نسبت وجود اسیدهای آمینه مختلف را در پروتئین ها در نظر بگیریم آنگاه وزن مولکولی متوسط به 128 نزدیک می گردد. از آنجایی که برای ایجاد هر پیوند پپتیدی، یک مولکول آب ( وزن مولکولی برابر 18 ) برداشت می شود، وزن مولکولی متوسط یک ریشه اسید آمینه موجود در پروتئین ها برابر 110 خواهد بود.

پلی پپتیدها دارای ترکیبات اسید آمینه ای مشخصی هستند

در اثر هیدرولیز اسیدی پپتیدها یا پروتئین ها، مخلوطی از α- آمینو اسیدهای آزاد بدست می آید. با هیدرولیز کامل هر نوع پروتئین نسبت یا مخلوط مشخصی از اسیدهای آمینه مختلف را ایجاد می نماید. بیست اسید آمینه معمول تقریباً هرگز به مقادیر برابر در پروتئین ها وجود ندارند. تعدادی از اسیدهای آمینه ممکن است تنها یکبار در ساختمان یک پروتئین خاص وجود داشته باشند و یا اصلاً در آن مشاهده نگردند؛ در حالیکه بقیه ممکن است به تعداد زیاد دیده شوند.

جدول زیر ترکیب مخلوط های اسید آمینه ای حاصل از هیدرولیز کامل سیتوکروم c و کیموتریپسینوژن ( پیش ساز غیر فعال آنزیم گوارشی کیموتریپسین )‌گاوی را نشان می دهد. این دو پروتئین که اعمال بسیار متفاوتی انجام می دهند، از نظر تعداد نسبی هر کدام از اسیدهای آمینه موجود نیز تفاوت قابل توجهی دارند.

 

 هیدرولیز کامل به تنهایی برای آنالیز دقیق ترکیب اسید آمینه ای کافی نیست. زیرا در طی آزمایش امکان انجام واکنشهای جانبی وجود دارد. برای مثال، پیوندهای آمیدی موجود در زنجیر جانبی آسپاراژین و گلوتامین در حضور اسید شکسته شده و در نتیجه آن به ترتیب موجب تولید آسپارتات و گلوتامات می گردد. در اثر هیدرولیز اسیدی، زنجیر جانبی تریپتوفان تقریباً بطور کامل تخریب می گردد و مقادیر کمی از سرین، ترئونین و تیروزین نیز از دست می روند.

 توالی پروتئین ها :‌تعیین ساختمان اولیه

تا زمانیکه درجه همگونی یک پپتید که به کمک روش SDS-PAGE تعیین می شود به بیش از 95 درصد نرسد، اطلاعات مربوط به توالی پپتیدها قابل تفسیر نخواهد بود. بنابراین لازم است ابتدا پپتیدها را به کمک تکنیکهای مرسوم برای تخلیص پروتئینها بصورت خالص تهیه کرد. از روش SDS-PAGE بطور گسترده برای تعیین وزن مولکولی پپتیدها با مقایسه قابلیت تحرک آنها با پپتیدهای استاندارد که وزن مولکولی آنها مشخص شده است، استفاده می شود.

معمولاً قبل از تعیین توالی اسیدهای آمینه موجود در یک پپتید ترکیب اسیدهای آمینه آن را تعیین می کنند تا اشتباهات احتمالی مشخص شده و اطلاعات بعدی در مورد توالی اسیدهای آمینه تایید گردد. ابتدا پیوند پپتیدی متصل کننده اسیدهای آمینه با روش هیدرولیز شکسته می شود، سپس اسیدهای آمینه آزاد شده با روش HPLC یا کروماتوگرافی مبادله یونی جدا و مشخص می شوند.

در هیچ فرآیندی هیدرولیز پپتیدها بطور کامل و بدون از دست رفتن برخی ترکیبات اعظم انجام نمی گیرد. روش انتخابی برای هیدرولیز پپتیدها با استفاده از نمونه های تکثیر شده در HCl 6 نرمال است که در دمای 110 درجه سانتیگراد و در لوله های شیشه ای دارای خلاء و کاملا در  بسته به مدت 24، 48، 72، 96 ساعت قرار می گیرند. این فرایند تمام مولکول های تریپتوفان ( Trp ) و سیستئین ( Cys ) را تخریب کرده و در صورت وجود یونهای فلزی برخی از مولکولهای متیونین ( Met ) و تیروزین ( Tyr ) نیز از بین می روند. اسیدهای آمینه سرین ( Ser ) و ترئونین ( Thr ) نیز بطور کامل بدست نمی آیند. پیوندهای بین دو مولکول والین ( Val-Val ) ، دو مولکول ایزولوسین ( Ile-Ile‌ ) و بین والین و ایزولوسین ( Val-Ile و Ile-Val ) در برابر هیدرولیز بسیار مقاوم بوده، اما گلوتامین ( Gln ) و آسپاراژین ( Asn ) گروههای آمید خود را از دست داده، به اسید گلوتامیک ( Glu ) و اسید آسپارتیک ( Asp‌ ) تبدیل می شوند.

سیستئین قبل از هیدرولیز به اسید سیستئیک که یک ترکیب مقاوم در برابر اسید است تبدیل می شود. میزان تریپتوفان به دنبال هیدرولیز بازی تخمین زده می شود. در این فرایند اسیدهای آمینه سرین، ترئونین، آرژنین، وسیستئین از بین می روند. اطلاعات مربوط به سرین و ترئونین از زمان صفر هیدرولیز استنتاج می شود و میزان والین و لوسین از اطلاعات ساعت 96 تخمین زده می شود.

Sanger اولین کسی بود که توالی یک پلی پپتید را مشخص کرد. Sanger در روش خود ابتدا دو زنجیره پلی پپتیدی A و B انسولین را از هم جدا کرده و سپس آنها را به کمک روشهای آنزیمی خاص به پپتیدهای کوچکتری تقسیم کرد که در این پپتیدها برخی توالی های مشابه وجود داشت. وی سپس با استفاده از 1- فلوئور و 2 و 4- دی نیتروبنزن هر بار یک ریشه اسید آمینه از انتهای N این پپتیدها را جدا و مشخص نمود. وی توانست با مقایسه توالیهای مشابه پپتیدها ساختمان اولیه هر دو زنجیر A و B را بطور قطعی مشخص کند.

 

 بعدها دو تکنیک تازه تر باعث ایجاد تحولی در روش تعیین ساختمان اولیه پلی پپتیدها ( پروتئین ها ) شد. تکنیک نخست که توسط Edman در سال 1967 ارائه شد روند برداشت متوالی اتوماتیک و تشخیص ریشه های اسید آمینه انتهای N بصورت مشتقات فنیل تیوهیدانتوئین آنها بود. تکنیک دوم معرفی شیوه تعیین توالی سریع DNA بود که بطور مستقل از یکدیگر توسط Sanger و توسط Maxam و Gilbert ارائه شد. در حال حاضر بهترین کار آن است که از هر دو روش همراه با هم استفاده شود.

 پیش از تعیین توالی اسیدهای آمینه باید پلی پپتیدهای بزرگ را خرد کرد :

وسایل تعیین توالی اتوماتیک اسیدهای آمینه ( Sequenator ) در مورد پلی پپتیدهایی که بطول 20 تا 60 ریشه اسید آمینه هستند، بهترین کارایی را دارند. بنابراین بهتر است خرد کردن مولکول پلی پپتیدهای بزرگ بصورت اختصاصی و کامل و در جایگاههای نسبتاً نادر انجام گیرد. ترکیبات زیر دارای این خصوصیت هستند :

1. CNBr : ابتدا ریشه های سیستئین با استفاده از اسید یدواستیک تغییر داده می شود، سپس مولکول CNBr عمل خرد کردن پپتیدها را از سمت CooH متیونین انجام می دهد. چون متیونین بطور نسبتاً نادر در پلی پپتیدها یافته می شود.

2. تریپسین : این آنزیم روی ناحیه CooH لیزین و آرژنین عمل می کند. چنانچه ابتدای ریشه های لیزین با استفاده از انیدرید سیتراکونیک به مشتق خود تبدیل شود، تریپسین تنها بر ریشه های آرژنین اثر خواهد کرد. تعداد ریشه های لیزین در پپتیدها نسبتاً بیشتر است. البته روش فوق برای خرد کردن قطعات بعدی به کمک CNBr مفید است.

3.ارتویدوزوبنزن : ریشه های نسبتاً نادر Trp-X را جدا می کند. در این روش نیازی به حفظ کردن ریشه های دیگر نیست.

4. هیدروکسیلامین : این ماده پیوندهای نسبتاً نادر بین آسپاراژین و گلیسین را قطع می کند. با این حال این روش فایده کمی چندانی ندارد.

5. پروتئاز V8 : از استافیلوکوک طلایی بدست می آید. ریشه های پپتیدی بین اسید گلوتامیک و ریشه X را قطع می کند. پیوند اسید گلوتامیک- لیزین در مقابل عمل این پروتئاز مقاوم است. انجام این واکنش قبل از خرد کردن قطعات در مرحله بعدی توسط CNBr مفید است.

6. هیدرولیز اسیدی ملایم : در این روش پپتید نادر بین اسید آسپارتیک و پرولین شکسته می شود.

 مخلوط پپتیدها را قبل از تعیین توالی آنها باید جدا کرد

برای تخلیص قطعات بدست آمده عمدتاً از روشهای زیر استفاده می شود :

1. صافی روی ژل در محلول اسید استیک یا اسید فرمیک.

2. کروماتوگرافی روی مایع با فاز معکوس.

3. کروماتوگرافی مبادله یونی روی فسفوسلولز یا سولفوفنیل ( Sephadex ) در محلول اسید فسفریک

 کروماتوگرافی مبادله یونی و الکتروفورز با ولتاژ بالا ( HVE‌)، مولکول ها را بر اساس بار الکتریکی جدا کرده و در مورد جداسازی پلی پپتیدها با وزن مولکولی پایین و نیز اسیدهای آمینه قابل استفاده اند. مقدار pK برای گروه کربوکسیل انتهای C در یک پلی پپتید بیشتر از گروه آلفا کربوکسیل در اسید آمینه مربوطه است. برعکس گروه آمین انتهای N نسبت به اسید آمینه مربوطه اسید قویتر است.

فیلتراسیون روی ژل : در روش تعیین توالی اتوماتیک تعداد کمی از پپتیدهای بزرگ ( 30 تا 100 ریشه ) مورد استفاده قرار می گیرد. ولی با این حال، ممکن است بسیاری از پلی پپتیدها با وزن مولکولی بالا که تخریب شده اند، نامحلول شوند زیرا طی فرایند تجزیه، ریشه های هیدروفوب که درون ساختمان پلی پپتید قرار داشته اند آشکار می شوند. برای حل این مشکل  می توان از اوره، الکلها، اسیدهای ارگانیک یا بازها استفاده کرد.

HPLC یا فاز معکوس : یک تکنیک موثر برای تخلیص پپتیدهای غیر قطبی با وزن مولکولی بالا، کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا روی ماده غیرقطبی همراه با شستشو توسط حلال های قطبی است. برای تخلیص مخلوطهای مرکب پپتیدی که از هضم ناکامل پروتئین ها بدست می آیند می آیند می توان از هر دو روش صافی روی ژل و HPLC فاز معکوس همراه با هم استفاده کرد.

HVE روی غربالهای مولکولی : برای تسهیل جداسازی مولکولها می توان از غربال مولکولی همراه با جداسازی بر اساس بار الکتریکی استفاده کرد. بیشترین ماده ای که در این زمینه بکار می رود پلیمری از آکریلامید با پیوندهای متقاطع است.

 پپتیدهای مهم طبیعی

1. گلوتاتیون : تری پپتید بسیار مهمی است که در بافتهای گیاهی و جانوری به وفور وجود داشته و از ریشه های اسید گلوتامیک، سیستئین و گلیسین تشکیل شده است. گلوتاتیون در واکنش های اکسیداسیون- احیاء شرکت می کند.

2.       کارنوزین و آنسرین : دی پپتید β- آلانین و هیستیدین بوده و در عضلات پرندگان دیده می شوند. آنسرین یک گروه متیل بیشتر از کارنوزین دارد و گاهی متیل کارنوزین هم نامیده می شود.

 

 3. اکسی توسین و وازوپرسین : این دو اولیگوپپتید، 9 ریشه ای بوده و به عنوان هورمون عمل می کنند. اکسی توسین از غده هیپوفیز قدامی ترشح شده و بر عضلات صاف و انقباضات رحمی اثر محرک دارد. وازوپرسین نیز از هیپوفیز ترشح شده و باعث افزایش فشار خون می گردد.

 

 4.برادی کینین : یک پپتید 9 ریشه ای ( نانوپپتید ) است که باعث کاهش فشار خون می گردد. ساختمان آن به قرار زیر است .Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg

 5. کورتیکوتروپین : یک هورمون موثر بر غدد فوق کلیوی است که از هیپوفیز قدامی ترشح می گردد. کورتیکوتروپین دارای 39 ریشه است و باعث تحریک رشد و فعالیت متابولیکی کورتکس غدد فوق کلیوی می گردد.

 6. انسولین : انسولین پلی پپتیدی با 51 ریشه است که از غده پانکراس ( لوزالمعده ) ترشح می شود. سکانس یا توالی اسیدهای آمینه موجود در ساختمان انسولین توسط « سانجر » در سال 1953 تعیین گردید. انسولین باعث کاهش قند خون می گردد.

[ ۱۳۸٩/۱٢/٢٧ ] [ ۸:۳٤ ‎ب.ظ ] [ امیر سالار سید رزاقی ] [ نظرات () ]
.: Weblog Themes By WeblogSkin :.
درباره وبلاگ

دانشجوی مهندسی ژنتیک (گیاهی)
لینک دوستان
امکانات وب