به مرکز تحقیقات ژنتیک خوش آمدید
 
قالب وبلاگ

 

برای تایید انجام کارهای مهندسی ژنتیک با ید تغییراتی که روی  DNA ایجاد شده است  رویت گردند، مشاهده DNA  متعافب الکتروفورز روی ژل آگارز یا پلی آکریلامید و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید امکان پذیر خواهد بود. برای انتخاب درصد آگارز از جدول شماره ۱استفاده می شود:

جدول شماره ۱ - قدرت جداسازی مولکولهای DNA  توسط غلظت های مختلف آگارز

درصد آگارز

قدرت جداسازی DNA

3

100-1000bp

2

200- 1500bp

1.5

300- 3000bp

1

500 – 5000bp

0.8

1000- 7000bp

0.6

10 – 30kbp

0.4

30 – 50kbp

برای مشاهده ادامه مقاله بر روی ادامه مطلب کلیک کنید.


 

تهیه  ژل  آگارز:

1-  قالب ژل را آماده کنید.

2- شانه ای با دنده های مناسب روی قالب قرار دهید.

3- حجم ژل مورد نظر را تعیین کنید ( اندازه گیری طول وعرض قالب و قطر ژل مورد نظر )

4- پودر آگارز را وزن کنید.

5- آگارز را در بافر 1xTBE حل کنید و آن را حرارت داده تا خوب بجوشد و قبل از خنک شدن به ازای هر 10 میلی لیترژل  یک میکرولیتر از محلول 10mg/ml اتیدیوم بروماید اضافه کنید  سپس آن را خوب مخلوط کرده و داخل قالب بریزید.

1xTBE= 89mM Tris base, pH8, 89mM boric acid, 2.5mM EDTA, pH8

6- بعد از بسته شدن ژل آن را از قالب خارج کرده و داخل تانک الکتروفورز قرار دهید.

7- هر 5 میکرولیترنمونه را با یک میکرولیتر بافر نمونه مخلوط کرده و داخل چاهک های ژل بریزید (این بافر حاوی 50درصد ماده سنگین کننده مانند گلیسرین یا ساکارز است که نمونه بخوبی داخل چاهک  ریخته میشود  و همچنین حاوی0.2 درصد از یک رنگ نشانه مانند بروموفنل بلو یا گزیلن سیانول میباشد . رنگ برومو فنل بلودر ژل 1.5 درصد همراه با  500bp  و درژل 0.8 درصد با 1000bpحرکت می کند).

جدول شماره ۲ :  مقایسه حرکت رنگ نشانه و مارکر DNA   روی ژل آگارز

درصد ژل آگارز

حرکت  تقریبی رنگ نشانه در مقایسه با مارکر

حرکت تقریبی  DNA   در مقایسه با مارکر

برومو فنل بلو

Xylen cyanol

0.4

500bp

3 kbp

2.5 kbp

0.8

500 bp

3 kbp

1kbp

1

500bp

3 kbp

500 bp

1.25

500 bp

3 kbp

250bp

1.5

100bp

1kbp

250bp

2

100bp

1kbp

100bp

جدول شماره ۳ :  مقایسه حرکت رنگ نشانه و مارکر DNA   روی ژل  پلی آکریلا مید

درصد ژل پلی آکریلامید

حرکت  تقریبی رنگ نشانه  در مقایسه با مارکر

حرکت تقریبی  DNA  در مقایسه با مارکر

برومو فنل بلو

Xylen cyanol

3.5

100bp

500 bp

100 bp

5

75bp

250bp

75bp

8

50bp

250bp

50 bp

12

25bp

75bp

25bp

15

10bp

60bp

25bp

20

10bp

60bp

5bp

8.- بافر تانک باید کاملا" روی  ژل  را بپوشاند و نمونه ها از داخل بافردرون چاهک ها ریخته شوند. (از بافرهای مختلف استفاده میگردد.   بهتر است هنگام الکتروفورز به ازای هر میلی لیتر بافر تانک  (TBE buffer) یک میکرو لیتر از اتیدیوم بروماید 10mg/ml  اضافه شود.

9- DNA دارای شارژ منفی است و برای الکتروفورز شدن باید  نمونه بطرف قطب منفی با شد  تا هنگام الکترو فورز به سمت قطب مثبت حرکت کند.

10- تانک الکتروفورز را به منبع تغذیه وصل کنید.

11-  پیچ Current را روی ماکزیمم قرار داده و ولتاژ را تنظیم کنید (10V/centimetr )

وقتی رنگ نشانه سه چهارم طول ژل را طی کرد ژل را از تانک خارج کرده بانورUV نتیجه را مشاهده کنید.

 

[ ۱۳۸٩/٢/۳ ] [ ٧:٥٩ ‎ب.ظ ] [ امیر سالار سید رزاقی ] [ نظرات () ]
.: Weblog Themes By WeblogSkin :.
درباره وبلاگ

دانشجوی مهندسی ژنتیک (گیاهی)
لینک دوستان
امکانات وب